Exemple des enzymes de restriction

Exemple des enzymes de restriction

Les enzymes de type III sont également de grandes enzymes de restriction et de modification des combinaisons. Environ 3 000 enzymes de restriction, qui reconnaissent plus de 230 séquences d`ADN différentes, ont été découvertes. L`essai clinique de phase I de la ZFN pour l`abolition ciblée du co-récepteur CCR5 pour le VIH-1 a été entrepris. Ils ont observé que le bactériophage qui se développait bien dans une souche bactérienne augmentait souvent mal en une seconde, formant seulement quelques plaques. La capacité des enzymes à couper l`ADN à des endroits précis a permis aux chercheurs d`isoler des fragments contenant des gènes et de les recombiner avec d`autres molécules d`ADN — i. Ce groupe est composé d`enzymes qui seraient autrement membres des classes communes de type II ou de type IIs. Site de clivage: Coupe d`une manière définie dans le site de reconnaissance ou à une courte distance. Par exemple, la différence de taux pour EcoRI sur son site apparenté (5 ́-GAATTC-3 ́) et le meilleur site suivant (5 ́-TAATTC-3 ́) est de l`ordre de 105 (1). Toute autre source d`ADN traitée avec la même enzyme produira de telles molécules. Les nucléases à doigt de zinc sont les enzymes de restriction artificielle les plus couramment utilisées et sont généralement utilisées dans les applications de génie génétique [47] [48] [49] [50], mais elles peuvent également être utilisées pour des applications de clonage de gènes plus courantes. Les enzymes appelées méthylases ajoutent des groupements méthyliques (— CH3) à des bases d`adénine ou de cytosine dans la séquence de reconnaissance, qui est ainsi modifiée et protégée de l`endonucléase. La souplesse et la facilité d`utilisation de ces enzymes les rendent prometteuses pour les futures applications de génie génétique. Ces enzymes contiennent plus d`une sous-unité et requièrent des cofacteurs d`AdoMet et d`ATP pour leur rôle dans la méthylation de l`ADN et la digestion des restrictions, respectivement.

AcuI (NEB #R0641): CTGAAG) et s`attacher d`un seul côté; et ceux qui reconnaissent des séquences discontinues (e. l`ADN non modifié (étranger), tel que celui d`un phage infectant, est dégradé par l`endonucléase, limitant l`infection de phage (d`où le terme endonucléase de restriction). Bien que toutes les enzymes de restriction présentent probablement une certaine diminution de la différence de taux de clivage entre les sites apparentés et proches-apparentés dans des conditions extrêmes telles que 4M d`éthylène glycol, la plupart ne sont pas significativement affectées dans des conditions d`utilisation communes. Il y a peu d`homologie de séquence d`acides aminés entre la nucléase et la méthylase dans un système de restriction/modification, même parmi les régions responsables de la reconnaissance. Pour cloner un fragment de gène dans un vecteur, l`ADN plasmide et l`insert génique sont généralement coupés avec les mêmes enzymes de restriction, puis collés avec l`aide d`une enzyme connue sous le nom de ligase d`ADN. Quand il entre en contact avec une séquence d`ADN avec une forme qui correspond à une partie de l`enzyme, appelé le site de reconnaissance, il enroule autour de l`ADN et provoque une rupture dans les deux brins de la molécule d`ADN. Les bactéries empêchent leur propre ADN d`être dégradée de cette manière en déguisant leurs séquences de reconnaissance. Ce brin de nucléotide en surplomb est appelé une extrémité collante parce qu`il peut facilement se lier avec des fragments d`ADN complémentaires. Les endonucléases de restriction de type IIM, telles que le DpnI, sont capables de reconnaître et de couper l`ADN méthylé. Ils requièrent la présence de deux sites de reconnaissance non méthylés inversement orientés pour que la digestion de restriction se produise. L`ADN activateur peut être nécessaire pour un clivage complet. L`une des enzymes les plus couramment utilisées dans le travail de l`ADN recombinant est l`Eco R1, qui est isolé d`Escherichia coli RY13.

Mélangés ensemble, ces molécules peuvent se joindre les unes aux autres par l`appariement de base entre leurs extrémités collantes. L`inversion se produit lorsque le groupe de départ 3 ́-OH est protoné par une eau à liaison Mg2 + à la sortie. Les séquences de reconnaissance peuvent également être classées par le nombre de bases dans son site de reconnaissance, généralement entre 4 et 8 bases, et le nombre de bases dans la séquence déterminera la fréquence à laquelle le site apparaîtra par hasard dans un génome donné, e. L`échantillon est d`abord digéré avec l`enzyme de restriction pour générer des fragments d`ADN, puis les différents fragments de taille séparés par électrophorèse sur gel.